蛋白质的测定

    (一)凯氏法      见GB12309—90 
     小麦淀粉、豌豆淀粉及蚕豆淀粉的换算系数为5．70。
     （二）分光光度法测定蛋白质
     1．原理
     在催化剂存在下，用硫酸裂解淀粉及其衍生物。然后碱化反应产物，并进行蒸馏使氨释放，同时用硫酸溶液收集。加入奈氏试剂，用分光光度计测定铵盐，并转换成氨含量。
    注：奈氏试剂 ：红棕色浓度低时，没有沉淀产生，但溶液呈黄色或棕色。
     2．试剂
     在测定过程中，只可使用分析纯的试剂和蒸馏水，或至少纯度相当的水。
  （1）浓 质量分数 9 6％， 为1.84g／ml。
  （2）NaOH溶液 质量分数 40％， 为1.43g／ml。
  （3）催化剂 9 7g 硫酸钾和 3g 无水硫酸铜。
  （4）硫酸铵。
  （5）0.1 mol／L 标准溶液。
  （6）奈氏试剂 将100g碘化汞和70g碘化钾溶于100ml水中，另将244g氢氧化钾溶于内有700ml水的1000ml容量瓶中，并冷却至室温。将上述碘化汞和碘化钾溶液慢慢注入容量瓶中，边加边摇动。加水至刻度，摇匀，放置至少2天。试剂应保存在棕色玻璃瓶中，置暗处。
  3．仪器
 （1）凯氏烧瓶 500～ 800ml。
 （2）凯氏定氮蒸馏装置 由抽空蒸馏瓶、蒸汽容人管、冷凝管、小漏斗、1000ml圆底烧瓶组成。 （3）100ml锥形瓶，200ml容量瓶。
 （4）分光光度计。
 （5）分析天平。
   4．测定步骤
    所测样品应充分混合，放在密封干燥的容器内。称取2～5g样品，精确至0.001g，倒人凯氏烧瓶内，注意不要将样品沾在瓶颈内壁上。加入3g催化剂，及为样品质量4倍的浓硫酸，轻轻摇动烧瓶，直至瓶内样品团块消失，使样品完全湿透，加入防沸物（如玻璃珠等）。烧瓶放在消化架上，小心加热使之逐渐沸腾，待液体澄清后继续加热lh。取下烧瓶，待瓶内液体冷却后，通过漏斗定量移入定氮蒸馏装置的蒸馏瓶中，并用水冲洗几次，直至蒸馏瓶内溶液总体积约200ml。调节蒸馏装置的冷凝管下端，使之恰好碰到盛有25ml 0.1ml／L硫酸溶液的容量瓶底部。再通过漏斗加入90m1 40％ NaOH溶液。注意漏斗颈部不能被排空，保证有液封。打开冷凝管的冷却水，开始蒸馏。经20～30min后，容量瓶收集液约 150ml 时即可停止蒸馏。
   降下容量瓶，使冷凝管离开液面，用水冲洗冷凝管，定容、摇匀。
   标准曲线的制备：
   分别吸取50ml不同铵盐浓度的标准溶液于100ml锥形瓶中，共取5份，其氮含量在 0～240 μg之间。各加入1.0 ml奈氏试剂，摇匀，放置10min后，以50ml水加1.0ml奈氏试剂的溶液为空白，在430nm处测定吸光度。
  吸取25～50ml经蒸馏后的样品溶液（估计其氮含量在标准曲线中间），放入100ml锥形瓶中，加水使体积为50ml，加1.0ml奈氏试剂，放置10min后，以50ml水加1ml奈氏试剂的溶液作空.